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10X Genomics - 5' Single Cell V(D)J Phenotyping & Gene Expression

Bei dem 5' Single Cell V(D)J Phenotyping & Gene Expression analysis Workflow handelt es sich um einen 5'-basierten Workflow zur parallelen Analyse des T-Zell Rezeptor bzw. des B-Zell Rezeptor Repertoires und der Genexpression in einzelnen Zellen. Hierzu werden einzelne Zellen mit Hilfe des Chromium Controllers zusammen mit einem Gel Bead, welcher verschiedene Barcodes beinhaltet, in winzige Wasser-in-Öl Tröpfchen verpackt. In diesem Reaktionsraum mit einem Volumen von ca. 1 nl wird die Zelle lysiert und die mRNA-Moleküle mit den in dem Gel Bead vorhandenen Barcodes versehen und in cDNA umgeschrieben. Im Anschluss wird die resultierende Emulsion chemisch gebrochen und die cDNA sequenzunabhängig amplifiziert. Für die Analyse des TCR bzw. BCR Repertoires wird ein kleiner Teil dieser amplifizierten cDNA als Template für ein TCR bzw. BCR spezifisches Target Enrichment verwendet. Aus der verbleibenden cDNA wird dann eine Illumina-kompatible Library zur Analyse der Genexpression erstellt. Nach der Sequenzierung lassen sich die Sequenzen dann bioinformatisch anhand der angefügten Barcodes den einzelnen Zellen bzw. Transkripten zuordnen. 

Es kann frei gewählt werden, ob innerhalb einer Probe nur das TCR bzw. das BCR Repertoire analysiert werden soll, oder ob diese Analysen mit der Genexpression gekoppelt werden sollen. Prinzipiell sind alle kombinatorischen Möglichkeiten aus TCR, BCR und Genexpressionsanalyse möglich.

Auf einem Chip des Chromium Controllers lassen sich maximal 8 Proben parallel bearbeiten. Für jede Probe können zwischen 500 und 10,000 Zellen analysiert werden. Dabei werden ca. 60% der eingesetzten Zellen tatsächlich analysiert. D.h. sollen für eine Probe 10,000 Zellen analysiert werden, sind als Ausgangsmaterial 17,000 Zellen nötig.

Probenanforderung

Als Ausgangsmaterial wird eine Einzelzellsuspension benötigt. Diese muss zwei entscheidende Kriterien erfüllen, um qualitativ hochwertige Daten liefern zu können.

Zum Einen dürfen ausschließlich vereinzelte Zellen in der Suspension vorhanden sein. Sollten Zellaggregate in der Suspension enthalten sein, müssen diese entfernt werden. Zum Anderen sollten die Zellen eine möglichst hohe Vitalität aufweisen. In der Suspension sollten nicht mehr als ca. 20 % tote Zellen enthalten sein. Ein zu hoher Anteil an toten Zellen, führt zu einem hohen Hintergrund Signal. Ggf. ist eine Entfernung der toten Zellen notwendig. 

Nach Eingang der Proben in unserem Labor werden diese einer Qualitätskontrolle unterzogen, bei der sowohl die Zellzahl als auch die Vitalität bestimmt wird.

Da es sich in diesem Falle bei dem Ausgangsmaterial um Zellmaterial handelt, klären Sie bitte im Vorfeld mit uns ab, ob Ihr Material in unserem Labor bearbeitet werden darf!

Verantwortlichkeit: