Nanopore - Amplicon/16S Sequencing

Bei dem Amplicon Sequencing werden ein bzw. mehrere Abschnitte der DNA gezielt amplifiziert. Dadurch können über Multiplexing Protokolle viele Proben auf einmal bearbeitet werden, wodurch die Kosten deutlich geringer sind als bei Whole Genome Sequencing Protokollen. Es gehen aber auch einige Informationen verloren, z.B. Methylierungsdaten.

Eine besondere Anwendung von Amplicon Sequenzierungen ist das 16S Sequencing zur Bestimmung mikrobieller Spezies aus natürlichen Populationen (Mikrobiom Metagenomics). Durch die lange Readlänge können die 16S Gene vollständig sequenziert werden, während bei short read Sequenziertechniken nur gewisse variable Bereiche abgedeckt werden. Dadurch ergibt sich ein deutlich höheres Auflösungsvermögen für die Speziesbestimmung.

Probenanforderung

Bezüglich der Qualität der DNA sollte der OD260/280 bei 1,8 und der OD260/230 bei 2,0-2,2 liegen.

Protokoll

DNA Menge

Multiplex

Volumen

16S Barcoding

10 ng gDNA pro Probe

bis zu 12

10 µl in neutralem Puffer, z.B.
10 mM Tris pH 8,5 (ohne EDTA)

1D PCR barcoding 96

0,5 nM Amplicon

bis zu 96

24 µl in neutralem Puffer, z.B.
10 mM Tris pH 8,5 (ohne EDTA)

1D PCR barcoding

0,5 nM Amplicon

bis zu 12

48 µl in neutralem Puffer, z.B.
10 mM Tris pH 8,5 (ohne EDTA)

1D amplicon by ligation

300 fmol* Amplicon

--

47 µl in neutralem Puffer, z.B.
10 mM Tris pH 8,5 (ohne EDTA)

Bitte Beachten Sie, dass die hier aufgeführten Mengen und Volumina die reinen Anforderungen des jeweiligen Kits sind! Um eine Qualitätskontrolle der Probe zu ermöglichen, geben Sie bitte einen ausreichenden Überschuss bei uns ab.

*Für die Ligation benötigen wir 200 fmol. Der Ligation sind jedoch weitere Reaktionen mit anschließender Aufreinigung vorgeschaltet. Um für die hierbei auftretenden Verluste zu kompensieren, benötigen wir mehr gDNA.

Leiter des GTL

Prof. Dr. Karl Köhrer

Biologisch-Medizinisches Forschungszentrum (BMFZ) Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Universitätsstr. 1 40225 Düsseldorf
Tel.: +49 211 81-13165
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