Nanopore - Whole Genome Sequencing

Beim Whole Genome Sequencing mittels Nanopore stehen mit dem Rapid Protokoll und dem Ligations Protokoll zwei verschiedene Protokolle zur Verfügung. Das Rapid Protokoll basiert auf einer Transposase-vermittelten Fragmentierung und ist für eine schnelle und einfache Probenprozessierung optimiert. Aufgrund dessen sind die Kosten für eine Probenprozessierung im Vergleich zu dem Ligations Protokoll geringer, allerdings sind Output und Read-Länge ebenfalls geringer. Bei dem Ligations Protkoll werden die Adapter mittels einer Ligation an die DNA ligiert und eine Fragmentierung ist optional. Daher ist hier der Output und die Read-Länge größer (für den Fall, dass keine Fragmentierung durchgeführt wurde). es können je nach Kit maximal 12 bzw. 24 Proben gemultiplexed werden.

Der Output einer FlowCell hängt maßgeblich von der Qualität, Quantität und der Fragmentlänge des Ausgangsmaterials ab. In der Regel variiert er zwischen 5 und 15 Gb. Während längere DNA Fragment auch zu längeren reads führen, sinkt jedoch der Geasmtoutput. Kürzere DNA-Fragmente hingegen führen zwar zu kürzeren reads, dafür aber zu einem höherem Gesamtoutput. Da wir für die Ligation etwa 200 fmol gDNA benötigen, variiert die benötigte DNA-Menge in Abhängigkeit von der Fragmentlänge der gDNA.

Die Gesamtkosten hängen maßgeblich von der benötigten Coverage ab. Anbei eine kleine Übersicht über grobe Richtlinien bezüglich der nötigen Coverage. undefinedKontaktieren Sie uns bitte für ein projektspezifisches Angebot.

  • Gap Filling: Die Nanopore Reads werden nur verwendet, um Lücken oder Unklarheiten in einem bereits bestehenden short-read scaffold Genom zu überspannen
  • Strukturvarianten (SV) Detektion: Hier wird das de novo assemblierte Genom gegen ein bekanntes Referenzgenom kartiert, um große strukturelle Unterschiede (z.B. Insertionen / Deletionen / Inversionen) zu detektieren
  • Hybrid assembly: Hier werden long und short read Daten in einem assembly kombiniert, um die Fehler beider Ansätze möglichst gering zu halten
  • De novo assembly: Es wird ein komplett neues, qualitativ hochwertiges Genom des Organismus erstellt, im Idealfall mit einer Sequenz pro Chromosom / Plasmid

Probenanforderung

Da die Sequenzierung mittels Nanopore ein Polymerase-unabhängiges Verfahren darstellt, ist die Readlänge lediglich durch die Größe der DNA Fragmente limitiert. Daraus folgt, dass eine bessere DNA-Präparation auch längere Reads zur Folge hat.

Bezüglich der Qualität der DNA sollte der OD260/280 bei 1,8 und der OD260/230 bei 2,0-2,2 liegen.

Protokoll

DNA Menge

Volumen

Rapid

400 ng hochmolekulare gDNA

7,5 µl in neutralem Puffer, z.B. 10 mM Tris pH 8,5 (ohne EDTA)

Ligation

1-2 µg hochmolekulare gDNA

45 µl in neutralem Puffer, z.B. 10 mM Tris pH 8,5 (ohne EDTA)

Bitte Beachten Sie, dass die hier aufgeführten Mengen und Volumina die reinen Anforderungen des jeweiligen Kits sind! Um eine Qualitätskontrolle der Probe zu ermöglichen, geben Sie bitte einen ausreichenden Überschuss bei uns ab.

Leiter des GTL

Prof. Dr. Karl Köhrer

Biologisch-Medizinisches Forschungszentrum (BMFZ) Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Universitätsstr. 1 40225 Düsseldorf
Tel.: +49 211 81-13165
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