PacBio - Whole Genome Sequencing

Beim Whole Genome SMRT Sequencing wird die hochmolekulare zunächst einheitlich in ca. 20 kb große Fragmente geschert und ohne Amplifikationsschritt zur Vorbereitung der Bibliotheken eingesetzt. Durch einen optionalen size-selection Schritt können kürzere Fragmente vor der Sequenzierung entfernt werden.
Eine SMRTCell liefert ca. 5-10 GB Output. Die Anzahl der benötigten SMRTCells – und damit ein Faktor zur Berechnung der Sequenzierkosten – variiert je nach Genomgröße des sequenzierten Organismus und gewünschter coverage:

  • Gap Filling: Das PacBio Assembly wird nur verwendet, um Lücken oder Unklarheiten in einem bereits bestehenden short-read scaffold Genom zu überspannen
  • Strukturvarianten (SV) Detektion: Hier wird das de novo assemblierte PacBio Genom gegen ein bekanntes Referenzgenom gemappt, um große strukturelle Unterschiede (z.B. Insertionen / Deletionen / Inversionen) zu detektieren
  • Hybrid assembly: Hier werden long und short read Daten in einem assembly kombiniert, um die Fehler beider Ansätze möglichst gering zu halten
  • De novo assembly: Es wird ein komplett neues, qualitativ hochwertiges Genom des Organismus erstellt, im Idealfall mit einer Sequenz pro Chromosom / Plasmid

Proben mit kleinen Genomen, z.B. Bakterien, können bis zu 16x gemultiplexed werden. Proben mit großen Genomen müssen meist auf mehreren SMRTCells parallel sequenziert werden, um eine ausreichend hohe coverage zu erhalten. Ein entsprechender undefinedRechner kann für die Berechnung verwendet werden.

Probenanforderung

Protokoll

DNA Menge

Volumen

Multiplexing

2 µg hochmolekulare gDNA je Probe

30-100 µl in neutralem Puffer,

z.B. 10 mM Tris pH 8,0 (ohne EDTA)

Einzelgenom

10-12 µg hochmolekulare gDNA 

(40-50 µl mit ~250 ng/µl)

30-100 µl in neutralem Puffer,

z.B. 10 mM Tris pH 8,0 (ohne EDTA)

Leiter des GTL

Prof. Dr. Karl Köhrer

Biologisch-Medizinisches Forschungszentrum (BMFZ) Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Universitätsstr. 1 40225 Düsseldorf
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