10X Genomics - 3' Single Cell Gene Expression analysis

Bei dem 3' Single Cell Gene Expression analysis Workflow handelt es sich um einen 3'-basierten Workflow zur Analyse der Genexpression in einzelnen Zellen. Hierzu werden einzelne Zellen mit Hilfe des undefinedChromium Controllers zusammen mit einem Gel Bead, welcher verschiedene Barcodes beinhaltet, in winzige Wasser-in-Öl Tröpfchen verpackt. In diesem Reaktionsraum mit einem Volumen von ca. 1 nl wird die Zelle lysiert und die mRNA-Moleküle über Ihren polyA-Schwanz mit den in dem Gel Bead vorhandenen Barcodes versehen und in cDNA umgeschrieben. Im Anschluss wird die resultierende Emulsion chemisch gebrochen und die cDNA sequenzunabhängig amplifiziert. Aus dieser cDNA wird dann eine Illumina-kompatible Library erstellt. Nach der Sequenzierung lassen sich die Sequenzen dann bioinformatisch anhand der angefügten Barcodes den einzelnen Zellen bzw. Transkripten zuordnen. 

Auf einem Chip des Chromium Controllers lassen sich maximal 8 Proben parallel bearbeiten. Für jede Probe können zwischen 500 und 10,000 Zellen analysiert werden. Dabei werden ca. 50% der eingesetzten Zellen tatsächlich analysiert. D.h. sollen für eine Probe 10,000 Zellen analysiert werden, sind als Ausgangsmaterial 20,000 Zellen nötig.

Probenanforderung

Als Ausgangsmaterial wird eine Einzelzellsuspension benötigt. Diese muss zwei entscheidende Kriterien erfüllen, um qualitativ hochwertige Daten liefern zu können.

Zum Einen dürfen ausschließlich vereinzelte Zellen in der Suspension vorhanden sein. Sollten Zellaggregate oder andere Verunreinigungen in der Suspension enthalten sein, müssen diese entfernt werden. Zum Anderen sollten die Zellen eine möglichst hohe Vitalität aufweisen. In der Suspension sollten nicht mehr als ca. 30 % tote Zellen enthalten sein. Ein zu hoher Anteil an toten Zellen, führt zu einem hohen Hintergrund Signal. Ggf. ist eine Entfernung der toten Zellen notwendig. 

Nach Eingang der Proben in unserem Labor werden diese einer Qualitätskontrolle unterzogen, bei der sowohl die Zellzahl als auch die Vitalität bestimmt wird.

Da es sich in diesem Falle bei dem Ausgangsmaterial um Zellmaterial handelt, klären Sie bitte im Vorfeld mit uns ab, ob Ihr Material in unserem Labor bearbeitet werden darf!

  • Zellvitalität: > 70%
  • optimale Konzentration: ~ 500 Zellen/µl
  • Min. Volumen: 50 µl
  • max. Zellgröße: 30 µm
  • empfohlener Puffer: PBS/0,5% BSA (kein Mg++, EDTA haltigen Puffer verwenden)

Leiter des GTL

Prof. Dr. Karl Köhrer

Biologisch-Medizinisches Forschungszentrum (BMFZ) Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Universitätsstr. 1 40225 Düsseldorf
Tel.: +49 211 81-13165
Fax: +49 211 81-11922
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