Sanger Sequenzierung

Um unseren DNA-Analytik-Service nutzen zu können, müssen Sie sich in unserem TSM-System registrieren.

Wir benötigen folgende Unterlagen:

a) Vor Abgabe Ihres ersten Auftrags benötigen wir eine Einwilligung zur Datenschutzerklärung. Diese erfolgt automatisiert im Zuge der Registrierung

b) Schriftliche Auftragserteilung, z.B. in Form eines „Blockzettels" oder eines Instituts-internen Auftragsscheins. Tragen Sie bitte die Anzahl der angeforderten Sequenzierungen, die gewünschte Leseweite (ca. 850 bp oder 500 bp) bzw. die Anzahl der Fragmentanalysen, die Kostenstellennummer sowie die Auftragsnummer ein und lassen ihn vom zuständigen Projektleiter unterschreiben.
Wir können nur Aufträge bearbeiten, die uns mit einem unterschriebenen Blockzettel erreichen.

c) DNA-Proben: Bitte beschriften Sie Ihre Proben-, bzw. Primergefäße gut leserlich. Achten Sie bitte auch auf übereinstimmende Bezeichnungen der jeweiligen Probe im Auftragsformular und auf dem Probengefäß.
Nach der Übermittlung Ihrer Daten mittels der Web-basierten Eingabemaske, bekommen Sie eine Auftragsnummer mitgeteilt.

Zu Dokumentationszwecken können Sie sich diese Seite ausdrucken. Die Auftragsnummer vermerken Sie bitte auf der Probentüte, bzw. Probenbox.

Sie werden automatisch per eMail über den Abschluss des Auftrages informiert und aufgefordert, Ihre Ergebnisse von unserem Server über den Menüpunkt in der Navigationsleiste auf Ihren eigenen Rechner zu transferieren (nur der "Download" der komprimierten "Zip"-Datei ist möglich).

Bitte beachten Sie auch die Kommentare, die Sie mit Ihren Sequenzdaten erhalten. Diese Informationen können wichtig für die Interpretation Ihrer Daten sein und enthalten gegebenenfalls auch Hinweise zum Gelingen weiterer Sequenzierungen.

Wir belassen Ihre Sequenzen mindestens ein Jahr auf unserem Server, so dass Sie auch die Ergebnisse älterer Aufträge langfristig abrufen können. Ihre (DNA) Proben bewahren wir allerdings nur ca. 1 Woche auf!

Wichtig: Ihre DNA-Proben dürfen maximal der Sicherheitsstufe S1 unterliegen.

Die exakte Konzentrationsangabe und die Qualität Ihres Templates (Plasmide oder PCR-Produkte) bestimmen maßgeblich den Erfolg der Sequenzierreaktion. Das Verhältnis der optischen Dichte (OD) bei 260 und 280 nm (OD_260/OD280) sollte zwischen 1.8 und 2.0 liegen.

Die DNA sollte in reinstem Wasser oder 10 mM Tris/HCl pH 8 gelöst sein. Auf keinen Fall darf die DNA zur Sequenzierung in TE [Tris/EDTA] aufgenommen sein.

Da wir die Analysen in gentechnischen Laboratorien der Sicherheitsstufe S1 durchführen, dürfen Ihre Proben auf keinen Fall einer höheren Sicherheitsstufe unterliegen!

a) Plasmide

Bei der Aufreinigung von Plasmid-DNA zur Sequenzierung ist auf eine effiziente Abtrennung von Proteinen, genomischer DNA, RNA, Salzen und Lösungsmitteln zu achten, z.B. mit kommerziellen Kits, um ein qualitativ hochwertiges Sequenzierergebnis (hohe Leseweite, gute Datenqualität) zu erhalten.

b) PCR-Produkte

PCR-Fragmente können ohne vorherige Subklonierung sequenziert werden, allerdings ist eine Aufreinigung der PCR-Fragmente zur Abtrennung der PCR-Komponenten (Primer, Nukleotide, Puffer) im Vorfeld der Sequenzierung unerlässlich. Diese kann mit handelsüblichen Kits, säulenbasierten Aufreinigungskits für PCR-Fragmente, Kits zur Elution von Fragmenten aus Agarosegelen oder durch spezifischen enzymatischen Verdau der Primer erfolgen.

Template-Mengen

Bitte überlassen Sie uns ausreichende DNA-Mengen, damit wir die Möglichkeit haben gegebenenfalls Optimierungs- bzw. Kontrollreaktionen durchführen zu können.

Wenn uns Ihre Proben vor 9 Uhr erreichen, erhalten Sie bei problemlosen Sequenzierungen die Ergebnisse in der Regel am folgenden Arbeitstag. Falls Sie besonders wichtige und dringende Proben haben, können diese Proben auch innerhalb von 4 Stunden bearbeitet werden (XPress-Service).

Sie können zwischen „long read" Analysen mit bis zu 1000 bp und "short read" Analysen mit ca. 500 bp Sequenzinformation wählen. Bitte vermerken Sie auf dem Auftragsformular/Abrechnungszettel deutlich die gewünschte Auftragskategorie (Leistungsspektrum).

Wichtig: „long read" und „short read" Analysen können in einem Auftrag nicht gemischt werden.

Natürlich können für die Sequenzierung auch Ihre eigenen Primer verwendet werden. Bitte beachten Sie:
Falls wir Ihre individuellen Primer benutzen sollen, müssen diese auf 10 pmol/µl eingestellt sein (entspricht 10 µM). Bitte teilen Sie uns auch den Tm-Wert Ihres Primers bei abweichender Annealingtemperatur mit (Standardeinstellung >= 50°C). Bei der Auswahl/Konstruktion Ihrer individuellen Primer beachten Sie bitte, dass zwischen dem 3'-Ende des Primers (Beginn der Sequenzierung) und den ersten verlässlich lesbaren Basen 30-50 Basen liegen sollten. Andernfalls gehen Ihnen möglicherweise Sequenzinformationen am 5'-Ende Ihrer Sequenz verloren.

Wir haben eine Vielzahl von Standardprimern vorrätig, die wir gerne kostenfrei für Ihre DNA-Sequenzanalyse einsetzen.

Aktuell vorhandene Primer:

Ihre (DNA) Proben bewahren wir ca. 1 Woche auf! Versehen Sie Ihren Auftrag / Probentüte mit einem entsprechenden Vermerk, wenn Sie Ihr Probenmaterial zeitnah abholen möchten. Wir belassen Ihre Sequenzen mindestens ein Jahr auf unserem Server, so dass Sie auch die Ergebnisse älterer Aufträge langfristig abrufen können.

Als Ergebnis der DNA-Sequenzierung erhalten Sie je sequenzierter Probe zwei Dateien mit den Endungen *.ab1 und *.seq. Ergebnisdateien der DNA-Fragmentanalyse tragen die Endung *.fsa. Es handelt sich um PC-Files. Mit folgenden Freeware-Programmen können Sie die Dateien öffnen:

• Konvertierungs-Programme:

   

  • Applied Biosystems

   

• Sequenzierung:

   

  • Edit View - Freeware (Nur für Macintosh Rechner bis OS 9.2)
  • Chromas - Nominal License Fee
  • FinchTV (PC, Macintosh, Linux)
  • Sequencher - Free Demo
  • Sequence Scanner Software

   

• Seqdatenprojekte:

   

  • DNAStar - Lasergene
  • Vector NTI - Free demo
  • Staden MAC OSX - Trev - Free for Academic Sites

   

• Fragment:

   

  • Peak Scanner Software v 1.0